زراعة الأنسجة Tissue Culture

السلام عليكم ورحمة الله وبركاته

زراعة الأنسجة Tissue Culture

سؤال يتردد كثيرا عن ما هو المقصود بزراعة الأنسجة و أهميتها لمربي النبات ؟
زراعة الأنسجة يقصد بها زراعة خلايا أو أنسجة أو أعضاء من أجزاء نباتية مختلفة تسمي (Explant) في أواني زجاجية أو بلاستيكية تحتوي علي البيئات المغذية الصناعية تتكون من العناصر الغذائية (عناصر مغذية كبري و صغري ) يحتاجها النبات الأم و يتم ذلك تحت ظروف غاية في التعقيد .
و الأواني بما تحتويه من بيئة غذائية و مادة نباتية يطلق عليها أسم (مزرعة أنسجة) و هذه المزارع يتم حفظها في الحضانات يتم التحكم فيها عن طريق التحكم في درجات الحرارة و الإضاءة وفقا للاحتياجات المناسبة لكل نبات .

أما عن أهميتها لمربي النبات :
1 – إنتاج نباتات خالية من الأمراض و خاصةً الفيروسية
2 – توفير المساحة و العمالة ~ التكلفة ~ الوقت ~ الأجزاء النباتية حيث أن ما تعطيه حجرة مساحتها 10م² تعادل ما تعطيه صوبة زراعية مساحتها 250 م²
3 – انتاج أعداد كبيرة من النباتات في فترة زمنية قصيرة جدا في أي وقت من السنة حيث أن النبات الواحد يمكنه إعطاء مليون نبات في السنة الواحدة
4 – التغلب علي مشاكل التربة التقليدية
5 – سهولة النقل من مكان لأخر كذلك الحفظ لفترات طويلة
6 – دراسة نمو و انقسام و تطور الخلية و كذلك دراسة تأثير العوامل الخارجية عليها
7 – دراسة منحني النمو للنباتات المختلفة
8 – دراسة مدي قدرة النباتات علي تحمل الظروف الغير ملائمة مثل الملوحة و الجفاف
9 – إنتاج المواد الفعالة الطبية و العطرية باستخدام مزارع الكالاس Callus
10 – استحداث الطفرات (التغيرات الجسمية)

ومن الطرق المختلفة لزراعة الأنسجة وفقا للمادة النباتية المنزرعة :
1 – إنتاج الكالاس Callus
2 – إنتاج النباتات الكاملة
3 – عزل و دمج و زراعة البروتوبلاست
4 – زراعة الخلايا المعلقة
5 – إنتاج أجنة جسمية
6 – إنتاج نباتات أحادية

لنتكلم بالتفصيل عن كل طريقة من الطرق السابق ذكرها علي حدة

1- إنتاج الكالاس
الكالاس هو عبارة عن خلايا بارنشيمية عشوائية الترتيب ناتجة عن الانقسام الخلوي للخلايا المكونة للجزء النباتي المنزرع علي بيئة مغذية و ذلك في المنطقة التي يقطع فيها النسيج النباتي في هذه الطريقة يتم تحويل الجزء النباتي من خلايا متخصصة إلي خلايا بارنشيمية غير متخصصة (مرستيمية) بأعداد كبيرة جدا يمكن فيما بعد استحداث تخصص هذه الخلايا عن طريق الإضافات العضوية المختلفة و التوازن الهرموني مما يساعد علي الإنتاج أعداد كبيرة من النباتات .

2- إنتاج النباتات
و في هذه الطريقة يتم استخدام القمة النامية أو أجزاء منها لإنتاج نباتات خالية من الأمراض الفيروسية و العقلة ذات برعم و ذلك لإنتاج نباتات متشابهة للنبات الأم و بأعداد كبيرة

3- زراعة الخلايا المعلقة
و يتم فيها استحداث الكالاس الهش علي بيئة غذائية مناسبة و ذلك علي هزاز لتفصيص الكالاس إلي أجزاء أصغر حتى يتم الحصول علي خلايا مفردة و يساعد علي ذلك استخدام الإنزيمات التي تشجع انفصال الخلايا أو استخدام جهاز الطرد المركزي حيث تزرع بعد ذلك في بيئة مغذية سائلة لإنتاج الأعداد الكبيرة من النباتات
4- عزل و دمج و زراعة البروتوبلاست
البروتوبلاست هو عبارة عن خلية منزوعة الجدار الخلوي و يتم عزل البروتوبلاست من بسترة الأوراق أو الكالاس أو حبوب اللقاح و يتم استخدام الإنزيمات في عزل البروتوبلاست ثم زراعته علي بيئة مناسبة لإنتاج أعداد كبيرة من النباتات المشابهة للنبات الأم أو عمل تهجين بين بروتوبلاست نبات من سلالة معينة و سلالة أخري من نفس الجنس لانتاج هجين جسمي في أقل فترة ممكنة

5- إنتاج أجنة جسمية
و فيها يتم استحداث أجنة جسمية من الكالاس أو استخدام النيوسيلة الموجودة في بعض أنواع الفاكهة لتكوين أجنة جسمية تنتج منها نباتات مشابهة للأم (الاستنساخ)

6- إنتاج نباتات أحادية
وفيها تستخدم حبوب اللقاح أو البويضات لإنتاج نباتات أحادية (نصف عدد الكروموسومات) التي يمكن عن طريق مضاعـفـتـها الحصول علي نباتات متجانسة تماما 100% في الصفات الوراثية

من العوامل التي تتحكم في زراعة الأنسجة :
1 – البيئة الصناعية
2 – التعقيم
3 – المطهرات
4 – الجزء النباتي
5 – درجة الحرارة
6 – الإضاءة
7 – نوع الغازات و تركيزها
8 – الزراعة الثانوية

من أسماء البيئات الغذائية المستخدمة في زراعة الأنسجة :

1) Vacia & Went (1945)
2) Heller (1953)
3) Murashige & Skoog (1962)
4) Anderson (1978)

أما مراحل زراعة الأنسجة النباتية :
1- مرحلة اختيار و إعداد النبات الأم
2- مرحلة تضاعف الأنسجة
3- مرحلة تكوين الجذور معمليا و القيام بالتهيئة
4- مرحلة تكوين الجذور خارج المعمل و الأقلمة

الملاحظات التي تأخذ عند استخدام الإكثار بمزارع الأنسجة
1) اللون البني للأنسجة Browning
في بعض مزارع الأنسجة لبعض الأنواع النباتية يلاحظ تغير أو تلون الأجزاء النباتية باللون البني أو ما يطلق عليه اسم Browning و غالباً هذا التلون يؤدي إلي تثبيط النمو و تموت بعده الأنسجة و تظهر عملية التلون باللون البني بوضوح بأنسجة الأنواع النباتية التي تحتوي علي مستويات مرتفعة من التانينات Tannins أو الهيدروكسي فينول HydroxyPhenol و يرجع التلون بالون البني إلي تأثير عمل بعض إنزيمات الأكسدة المحتوية علي النحاس التي تنطلق و تظهر نتيجة لجرح الأنسجة أثناء عملية الفصل أو التعقيم

كيفية منع أو تقليل تلون النسيج باللون البني :
1) عن طريق التخلص من المواد الفينولية المتكونة
2) عن طريق عدم تنشيط الإنزيمات المرتبطة بتكوين المواد الفينولية

و يمكن التخلص من المركبات الفينولية أثناء عملية التلوين باللون البني عن طريق
① نقل الأنسجة علي بيئة جديدة علي فترة من 1 يوم – 5 أيام خلال الأسابيع الأولي من الزراعة و ذلك حتى لا تتراكم كمية كبيرة من المركبات الفينولية في مزارع الأنسجة و يمكن أن يتم ذلك من خلال إعادة زراعة الأنسجة Subculture علي بيئة سائلة Liquid Medium بدلا من البيئة الصلبة Soil Medium خلال فترة الأسابيع الأولي من عمر المزرعة .
② إضافة بعض المركبات مثل الفحم النشط بتركيز 2¸ -- 3% وزن / جم أو بولي فينيل بيرولودين Polyvinyl Pyrolodine (P.V.P) بتركيز بالحجم 250 – 1000 ملليجرام / لتر
③ باستخدام مضادات الأكسدة Anti Oxidation و يتم ذلك بوضع النسيج القابل للتلون بمحلول يحتوي علي مضاد للأكسدة و بعد القطع مباشرةً و من أشهرها حمض السيتريك , حمض الأسكوربيك المعروف باسم فيتامين C

2) ظاهرة التزجج Vitrification
في مزارع الأنسجة لبعض النباتات يلاحظ شفافية النموات الخضرية و تحولها الي الون الأخضر الباهت و زيادة محتواها من الماء مع هشاشة الأنسجة و تسمي بظاهرة الشفافية أو الرطوبة الزائدة أو التشبع بالماء أو التزجج.
السبب
و ترجع هذه الظاهرة الي زيادة كمية الماء المتاحة في مزارع الأنسجة و بالتالي في النباتات أو النموات الخضرية و يحدث ذلك عادة في المزارع السائلة أو المزارع التي يستخدم فيها الأجار بتركيزات منخفضة .
وهذه الظاهرة أكثر شيوعا في القرنفل و الخرشوف

كيفية التغلب علي ظاهرة التزجج
① زيادة تركيز كل من الأجار و السكر في البيئة أو كلاهما معا .
② تحسين عملية التبادل الغازي داخل مزارع الأنسجة من خلال حجم الأواني الزجاجية و نوع الأغطية .
③ ارتفاع مستويات السيتوكينين في مزارع الأنسجة .
④ تظهر هذه الظاهرة بوضوح بانخفاض شدة الاضاءة و ارتفاع درجات الحرارة
⑤ تظهر هذه الظاهرة بوضوح مع زيادة في التعقيم للأجزاء النباتية المستخدمة
⑥ يمكن تقليل هذه الظاهرة بتغيير مخلوط أملاح البيئة و استبداله بأملاح بيئة أخري أو تغير نسب الأملاح في بيئة الزراعة
⑦ يمكن تقليل هذه الظاهرة في مزارع بعض الأنواع النباتية باستخدام
بيئة تحتوي علي (Z-Phasmedie) طبقتين :طبقة صلبة و أخري سائلة

و تنتج هذه الظاهرة نتيجة للتغير في مكونات البيئة و التغير في المكونات الطبيعية للبيئة من ضوء و حرارة و رطوبة و كذلك التغير في المكونات العضوية و غير العضوية في البيئة , وكذلك التغير في منظمات النمو المضافة للبيئة .
لهذا يراعي زيادة تركيز السكر أو المانيتول في البيئة و ارتفاع تركيز العناصر الغذائية مثل الأمونيا NH4+
ونقص تركيز Ca الكالسيوم و ارتفاع تركيزMg كذلك يراعي زيادة العناصر الصغري في البيئة .